Технологии

Кровь: новое прочтение

Как работает первая специализированная лаборатория для типирования потенциальных доноров костного мозга

12 сентября состоялся запуск совместной лаборатории Русфонда и Казанского (Приволжского) федерального университета (КФУ): там будут определять HLA-фенотипы (маркеры ДНК-совместимости) потенциальных доноров Национального регистра доноров костного мозга имени Васи Перевощикова. Как работает новая лаборатория – в репортаже Русфонда.

Эта лаборатория – общее дело. Казанский федеральный университет предоставил 170 кв. м площади – шесть комнат, специально отремонтированных для работы с биоматериалами, а также персонал, имеющий необходимый опыт. Русфонд приобрел оборудование, в том числе дорогостоящий секвенатор MiSeq компании Illumina, который за один цикл сможет определять HLA-фенотипы почти 200 человек. Русфонд будет также поставлять лаборатории образцы крови добровольцев для типирования и необходимые реактивы.

Благодаря новой лаборатории в 2019 году Национальный регистр сможет увеличиться почти на 25 тыс. человек. Для сравнения: за 2017 год 15 российских регистров вместе протипировали 15 тыс. добровольцев.

– По предложению основателя и президента Русфонда Льва Амбиндера мы создали первое наше совместное предприятие почти полгода назад – Приволжский регистр потенциальных доноров костного мозга, – рассказывает ректор КФУ Ильшат Гафуров. – Теперь второй шаг: на базе Института фундаментальной медицины и биологии создали лабораторию. Мы хотим сформировать регистр доноров не только для Приволжского округа, но для всей страны. Мы хотим, чтобы в Национальном регистре были миллионы добровольцев.

Коктейль из ДНК

Новая лаборатория располагается в двухэтажном здании университетской клиники и занимает часть первого этажа. С улицы сюда ведет отдельная дверь, но входить в нее позволено лишь курьерам, которые доставляют образцы – пробирки с кровью. Сами сотрудники лаборатории, семеро специалистов, входят с противоположной стороны – через клинику.

– Вот здесь мы проводим первичную сортировку образцов, – начинает экскурсию заведующая новой лабораторией Елена Шагимарданова. – Затем пробирки с кровью передаются через окошко в следующую комнату, где происходит выделение ДНК. Вот этот прибор, похожий на ксерокс, на самом деле робот для выделения ДНК. Вручную выделять ДНК из партии пробирок с кровью пришлось бы неделями.

Робот передает эстафету людям: сотрудники лаборатории берут несколько микролитров выделенной ДНК и помещают их в ячейку специального планшета размером 10 на 15 см. Всего в планшете 96 ячеек – в них можно загрузить образцы ДНК 94 человек плюс два контрольных. То, что происходит с планшетом дальше, напоминает эпизод из научно-фантастического фильма.

Каждая цепочка ДНК хранит генетическую информацию о человеке при помощи трех миллиардов пар оснований. Биологи с помощью передовых технологий выделяют из цепочки только пять необходимых отрезков-локусов, содержащих гены тканевой совместимости. Затем пробирки с локусами отправляются (через очередное окошко) в следующую комнату, где их помещают в специальные приборы, которые в течение семи часов нагревают и остужают образцы, пока они размножаются посредством полимеразной цепной реакции. В результате количество фрагментов каждого из пяти локусов каждого образца увеличится в миллионы раз.

Далее идет последняя фаза ручной работы – создание библиотеки для секвенирования. В пробирки добавляется рестриктаза – фермент, который, как ножницы, разрезает цепочки фрагментов ДНК в случайных местах, чтобы получить более короткие отрезки (секвенатор MiSeq умеет читать только короткие отрезки). К каждому отрезку ДНК каждого из доноров пришивается так называемый бар-код, то есть штрих-код, исполненный в молекулярном варианте. Зачем? Чтобы после секвенирования можно было разобраться, где чья ДНК.

Дело в том, что после бар-кодирования все образцы из подготовленных планшетов смешиваются в одной пробирке. Содержимое коктейля из «пронумерованных» кусочков ДНК двух сотен человек как раз и называется библиотекой для секвенирования.

Следующая операция – самая дорогостоящая во всем процессе HLA-типирования. Полученная «библиотека» тонким слоем наносится на небольшое стеклышко, которое на самом деле стоит огромных денег и называется «ячейка». Его помещают в секвенатор, и тот наконец приступает к работе.

Чтение одной такой ячейки, то есть секвенирование ДНК каждого из 188 потенциальных доноров плюс четырех контрольных образцов, занимает у MiSeq трое суток. Еще сутки требуются для расшифровки полученных данных, которые передадут из лаборатории в Национальный регистр доноров костного мозга имени Васи Перевощикова.

– Большую часть процессов, которые мы пока делаем вручную, можно автоматизировать, – говорит Елена Шагимарданова. – И я, конечно, мечтаю о подобном оборудовании, но, с другой стороны, даже хорошо, что у нас его пока нет. Я хочу, чтобы сотрудники лаборатории поработали какое-то время руками, чтобы они понимали, что и как здесь происходит, а не только умели нажимать кнопку «старт».

300 тысяч доноров через пять лет

Из-за высокой стоимости реагентов типирование одного образца обходится сегодня в 7000 рублей. Еще год назад оно было вдвое дороже. В настоящее время Русфонд ведет с несколькими отечественными компаниями переговоры о разработке, производстве и поставках некоторых реагентов. Если проект заработает и отечественные реагенты покажут себя не хуже иностранных, стоимость одной процедуры типирования получится еще снизить.

В будущем Русфонд и КФУ собираются расширить возможности лаборатории, поставив в нее еще один секвенатор. Цель – совместными усилиями увеличить число потенциальных доноров костного мозга в Национальном регистре до 300 тыс. человек за ближайшие пять лет. Это еще не миллионы, но уже весьма серьезная база для всех нуждающихся.

Фото Натальи Дорошкевич